Folyékony biopsziák a rák diagnosztizálására

Jellemzően a tumorokat szöveti biopsziák alkalmazásával vizsgáljuk. Egy kis mintát veszünk a tumorból, és genotípusosítunk, vagy genetikai sminket elemezünk. Ennek a megközelítésnek a problémája az, hogy a biopsziás tumorok kihívást jelenthetnek. Továbbá a tumor biopsziája csak egy pillanatfelvételt ad a tumorról.

Írás Discovery Medicine 2015-ben a Labgaa és a társszerzők a hagyományos daganatos biopsziáról szólnak:

"Nyilvánvaló okokból nehéz a daganatok fejlődését szekvenciális biopsziákkal ellenőrizni. A biopszia csak a tumor egyetlen pontját tükrözi, és ezért valószínű, hogy nem képviseli a nagy tumorok szomatikus mutációinak teljes spektrumát. ugyanazon daganat biopsziája, de ez az opció sem reális, sem pontos.

A folyékony biopszia magában foglalja a keringő DNS (ctDNS) és más tumor melléktermékek mérését a rákos betegek vérmintáiban. Ez a kialakuló diagnosztikai megközelítés gyors, nem invazív és költséghatékony.

A folyékony biopszia története

1948-ban Mandel és Métais, egy pár francia kutató először azonosította a ctDNS-t az egészséges emberek vérében. Ez a felfedezés idő előtt állt, és nem volt több évtizeddel később, hogy a ctDNA-t tovább vizsgálták.

1977-ben Leon és munkatársai először meghatározták a rákos betegek vérében a ctDNS mennyiségének növekedését. 1989-re Stroun és munkatársai azonosították a vérben a neoplasztikus (azaz a rák) jellemzőit. E felfedezések után számos más csoport azonosított specifikus mutációkat a tumorszuppresszorokban és az onkogénekben, mikroszatellit instabilitásban és a DNS-metilációban, amelyek bizonyították, hogy a ctDNS a tumorok keringésében szabadul fel.

Bár tudjuk, hogy a daganatsejtekből származó ctDNS kering a vérben, a DNS eredete, felszabadulási sebessége és felszabadulási mechanizmusa nem tisztázott, és a kutatás ellentmondásos eredményeket hoz. Egyes kutatások azt mutatják, hogy több rosszindulatú daganat több halott rákos sejtet tartalmaz, és több ctDNS-t szabadít fel. Néhány kutatás azonban arra utal, hogy minden sejt ctDNS-t szabadít fel. Mindazonáltal valószínűnek tűnik, hogy a rákos daganatok növelik a ctDNS szintjét a vérbe, így a ctDNS a rák jó biomarkere.

A ctDNS-t nehéz a fragmentáció és az alacsony koncentráció miatt nehéz izolálni és elemezni. A szérum és a plazma minták között a ctDNS-koncentrációk eltérnek.Úgy tűnik, hogy a vérszérum helyett a vérplazma jobb ctDNS forrása. Egy Umetani és munkatársai által végzett vizsgálatban a ctDNS-koncentrációk a plazmában a szérumhoz képest állandóan alacsonyak voltak a tisztítás során a keringő DNS esetleges elvesztése miatt, mivel a véralvadás és más fehérjék eliminálódnak a minta előkészítése során.

Heitzer és munkatársai szerint néhány olyan konkrét kérdés merül fel, amelyekkel a ctDNS diagnosztikai potenciálját hasznosítani kell:

„Először is standardizálandó eljárásokat kell szabványosítani… A kritikus fontosságú a megfelelő mennyiségű kiváló minőségű DNS kivonását biztosító izolációs módszer kiválasztása, és bebizonyosodott, hogy a vérmintavétel és -feldolgozás preanalitikus tényezői erősen befolyásolhatják a DNS-hozamot…. Másodszor, az egyik legfontosabb kérdés a mennyiségi meghatározási módszerek harmonizációjának hiánya, a különböző számszerűsítési módszerek, … különböző eredményeket hoznak létre, mivel ezek a mérések a teljes vagy csak az amplifikálható DNS-t célozzák. a ctDNS felszabadulásának mechanizmusa, és a legtöbb tanulmányban zavaró események, amelyek szintén hozzájárulhatnak a ctDNS kibocsátásához."

Célzott és nem célzott megközelítések

Jelenleg a ctDNS vérplazma (vagy szérum) elemzése során két fő megközelítést alkalmaznak. Az első megközelítés célzott, és specifikus genetikai változásokat keres a tumorokra. A második megközelítés nem célzott és magában foglalja a rákot tükröző ctDNA-t kereső genom-kiterjedt elemzést. Alternatív megoldásként az exome szekvenálást költséghatékonyabb, nem célzott megközelítésként használták. A kivételek a DNS azon részei, amelyeket fehérjék előállítására átírtak.

Célzott megközelítések esetén a szérumot az ismert genetikai mutációk alapján elemezzük kis vezetői mutációkban. A meghajtó mutációk a genomban levő mutációkra utalnak, amelyek elősegítik vagy „hajtják” a rákos sejtek növekedését. Ezek a mutációk közé tartozik KRAS vagy EGFR.

Az utóbbi évek technológiai fejlődésének köszönhetően a ctDNS kis mennyiségű genomra vonatkozó célzott megközelítése megvalósíthatóvá vált. Ezek a technológiák magukban foglalják az ARMS-t (amplifikációs refraktív mutációs rendszer); digitális PCR (dPCR); gyöngyök, emulziók, amplifikáció és mágnesek (BEAMing); és mély szekvenálás (CAPP-Seq).

Annak ellenére, hogy előrelépés történt a célzott megközelítést lehetővé tevő technológia terén, a célzott megközelítés csak a mutációk néhány pozícióját célozza meg (hotspotok), és hiányzik a sok vezetői mutáció, mint például a tumorszuppresszor gének.

A folyékony biopszia célzott megközelítésének fő előnye, hogy minden betegben alkalmazhatók, mivel a vizsgálat nem függ a visszatérő genetikai változásoktól. Az ismétlődő genetikai változások nem fedik le az összes rákot, és nem specifikus rákos aláírások. Ennek a megközelítésnek azonban nincs analitikus érzékenysége, és a tumor genomok átfogó elemzése még nem lehetséges.

Megjegyzendő, hogy a teljes genom szekvenálásának ára lényegében csökkent. 2006-ban az egész genom szekvenálásának ára körülbelül 300 000 dollár volt (USD). 2017-ig a költségek körülbelül 1 000 dollárra (USD) csökkentek egy genomra, beleértve a reagenseket és a szekvenáló gépek amortizációját.

A folyékony biopszia klinikai hasznossága

A ctDNS használatára irányuló kezdeti erőfeszítések diagnosztikusak voltak, és összehasonlították az egészséges betegek szintjét a rákos betegek vagy a jóindulatú betegséggel rendelkező betegek szintjével. Ezeknek az erőfeszítéseknek az eredményei vegyesek voltak, csak néhány tanulmány mutatott jelentős eltéréseket, amelyek rákot, betegségmentes állapotot vagy visszaesést jeleztek.

Az ok, amiért a ctDNS-t csak a rák diagnosztizálásának idejére lehet használni, az az, hogy a ctDNS változó mennyisége tumorokból származik. Nem minden daganat ugyanolyan mennyiségben „eldobja” a DNS-t. Általánosságban elmondható, hogy a fejlettebb, szélesebb körben elterjedt daganatok több DNS-t helyeztek a keringésbe, mint a korai, lokalizált tumorok. Ezenkívül a különböző tumor típusok különböző mennyiségű DNS-t helyeztek a keringésbe. A tumorból származó keringő DNS frakciója széles körben változik a vizsgálatok és a ráktípusok között, 0,01% és 93% között. Fontos megjegyezni, hogy általában a ctDNS-nek csak egy kisebb része származik a tumorból, a többi pedig a normál szövetekből származik.

A keringő DNS felhasználható a betegség prognosztikai markereiént. A keringő DNS felhasználható a rák időbeli változásainak megfigyelésére. Például az egyik vizsgálat kimutatta, hogy a vastagbélrákos betegek kétéves túlélési aránya (azaz a kolorektális rákos megbetegedés után legalább két évig életben maradt betegek száma) és KRAS a hotspot-mutációk 100% -uk voltak azokban, akik nem bizonyították a megfelelő keringő DNS-t. Ezenkívül lehetséges, hogy a közeljövőben a keringő DNS felhasználható a megelőző elváltozások megfigyelésére.

A keringő DNS felhasználható a terápiára adott válaszok ellenőrzésére is. Mivel a keringő DNS jobban átfogó képet ad a daganatok genetikai alkotórészéről, ez a DNS valószínűleg diagnosztikus DNS-t tartalmaz, amely a daganatokból származó diagnosztikai DNS helyett alkalmazható.

Most nézzük meg a folyékony biopszia néhány konkrét példáját.

Guardant360

A Guardant Health egy olyan tesztet dolgozott ki, amely a következő generációs szekvenálást alkalmazza a keringő DNS-ek profilozására 73 rákkal összefüggő gén mutációinak és kromoszómális átrendeződésének vizsgálatára. A Guardant Health tanulmányt tett közzé, amely a folyékony biopszia alkalmazhatóságáról számol be az onkológiában. A vizsgálatban 15 000, 50 kombinált tumor típusú betegből származó vérmintákat használtunk.

A legtöbb esetben a folyékony biopsziás vizsgálat eredményei igazodtak a tumor biopsziákban megfigyelt génváltozásokhoz.

Az NIH szerint:

"A Guardant360 azonos fontos kritériumokat azonosított a fontos rákkal kapcsolatos génekben EGFR, BRAF, KRAS, és PIK3CA- a tumor biopsziás mintákban korábban azonosított frekvenciákon, amelyek statisztikailag 94% -tól 99% -ig korrelálnak."

Továbbá az NIH szerint a kutatók a következőket jelentették:

"A vizsgálat egy második komponensében a kutatók közel 400 beteget vizsgáltak - akiknek többsége tüdő- vagy vastagbélrákos volt - akiknek mind a vér ctDNS-, mind a tumorszöveti DNS-eredményei rendelkezésre álltak, és összehasonlították a genomiális változások mintáit. A biopszia a tumor biopsziás vizsgálatok eredményeihez viszonyítva 87% volt, a pontosság 98% -ra emelkedett, amikor a vér és a tumormintákat egymás után 6 hónapon belül gyűjtötték.

A Guardant360 pontos volt, bár a vérben keringő DNS szintje alacsony volt. Gyakran a keringő daganat DNS csak a vérben lévő DNS 0,4% -át tette ki.

Összességében, a folyékony biopsziát használva, a Guardant kutatók képesek voltak azonosítani a tumor markereket, amelyek a betegek 67 százalékában orvosok kezelésére irányíthatók. Ezek a betegek jogosultak voltak az FDA által jóváhagyott kezelésekre, valamint a vizsgálati terápiákra.

ctDNS és tüdőrák

2016-ban az FDA jóváhagyta a cobas EGFR mutációs tesztet, amelyet a EGFR mutációk a tüdőrákos betegek keringő DNS-ben. Ez a vizsgálat volt az első FDA által jóváhagyott folyékony biopszia, és azonosította azokat a betegeket, akiket célzott terápiákkal lehet kezelni az erlotinib (Tarceva), az afatinib (Gilotrif) és a gefitinib (Iressa) első kezelésként történő alkalmazására, és az osimeritinib (Tagrisso) másodlagos kezelés. Ezek a célzott terápiák specifikusan támadják meg a rákos sejteket EGFR mutációk.

Fontos, hogy az FDA a hamis negatív eredmények nagy száma miatt javasolja a szövetbiopsziás mintát egy negatív folyékony biopsziával rendelkező betegből is.

ctDNS és májrák

Az elmúlt 20 évben nőtt a májrákban halt emberek száma. Jelenleg a májrák a rákos halálozás második legnagyobb oka a világon. Nincsenek jó biomarkerek a máj vagy hepatocelluláris (HCC), rák kimutatására és elemzésére. A keringő DNS jó biomarker lehet a májrák számára.

Tekintsük a Lagbaa és társszerzők következő idézetét a keringő DNS használatának lehetőségéről a májrák diagnosztizálására:

"A RASSF1A, p15 és p16 hipermetilációját korai diagnosztikai eszközként javasolták 50 retrospektív páciensből álló retrospektív vizsgálatban. Négy gátlóan metilált gén (APC, GSTP1, RASSF1A és SFRP1) aláírását diagnosztikai pontossággal tesztelték, míg A RASSF1A metilációját prognosztikai biomarkerként jelentették be, a későbbi vizsgálatokban a HCC-ben szenvedő betegeknél a ctDNS-t mély szekvenálási technológiákkal vizsgálták. Ez a megállapítás kinyitotta az ajtót, hogy értékelje a ctDNS másolati számváltozását mint a HCC korai felismerésének szűrőeszközeit."

Egy szó a DipHealth-től

A folyékony biopsziák izgalmas új megközelítés a genomiális diagnózishoz. Jelenleg bizonyos folyékony biopsziák, amelyek átfogó molekuláris profilokat kínálnak, az orvosok rendelkezésére állnak a szöveti biopsziából nyert genetikai információk kiegészítésére. Vannak bizonyos folyékony biopsziák is, amelyeket a szöveti biopszia helyett lehet alkalmazni, amikor a szöveti biopsziák nem állnak rendelkezésre.

Fontos szem előtt tartani, hogy számos folyékony biopsziás vizsgálat jelenleg folyamatban van, és további kutatást kell végezni a beavatkozás terápiás hasznosságának megteremtése érdekében.